目的  采用40层细胞工厂(40-layer cell factory, CF40)工艺培养原代地鼠肾(primary hamster kidney, PHK)细胞，优化乙脑减毒活疫苗的生产工艺。

方法  用不同浓度新生牛血清培养不同接种密度PHK细胞，比较各组PHK细胞数量，确定CF40工艺的PHK细胞接种密度和新生牛血清浓度。通过对比CF40和15 L转瓶采用不同新生牛血清的PHK细胞培养情况，比较两种工艺对新生牛血清的选择性。对4个厂家CF40培养的PHK细胞数量进行单因素方差分析，判定对CF40的选择性。

结果  CF40工艺的*条件为PHK细胞接种密度6.1×10⁵ ml^-1、新生牛血清浓度6%。CF40工艺对新生牛血清的选择性较低，能比转瓶工艺更稳定地培养更多的PHK细胞。4个厂家CF40培养的PHK细胞数量之间的差异无统计学意义（F=0.23，P＞0.05），对CF40选择性低。

结论  采用CF40可以制备出满足乙脑减毒活疫苗生产要求的PHK细胞。

流行性乙型脑炎（乙脑）是经蚊虫传播的急性神经系统传染病^[1-2]，全球每年报告约68 000 例乙脑病例，病死率约为30％，且在幸存者中，30％～50％会出现严重的神经系统和精神方面的后遗症^[3]。目前较为有效的预防方法是接种乙脑减毒活疫苗，且大量临床研究证明乙脑减毒活疫苗具有良好的免疫原性和安全性^[4-5]。随着国家对预防用生物制品质量和生产工艺要求的逐渐提高，企业应采用可控性强、操作便利、节约生产成本和空间的生产工艺制备疫苗^[6]。

目前，乙脑减毒活疫苗采用的是15 L转瓶工艺，而乙脑病毒单一病毒收获液的收量取决于原代地鼠肾（primary hamster kidney, PHK）细胞的质量，由于转瓶工艺受控于人为因素较多，因此本试验采用40层细胞工厂(40-layer cell factory, CF40)工艺培养PHK细胞，并对各关键工艺参数及材料进行优化，以制备符合生产要求、一致性更好的PHK细胞。

PHK细胞由成都生物制品研究所有限责任公司（成都公司）病毒性疫苗一室使用成都公司动物室提供的10~14日龄黄金地鼠〔许可证号SCXK（川）2021-126〕制备。

新生牛血清分别购自兰州荣晔生物科技有限责任公司、山西润生大业生物材料有限公司、呼和浩特市草原绿野生物工程材料有限公司和美国Gibco公司，109培养基由成都公司配制，胰蛋白酶购自美国Gibco公司， CF40分别购自美国Corning公司、Nunc公司、FeiFanT公司和DHS公司；520 DI／REL蠕动泵购自斯派莎克工程（中国）有限公司，SHXJ-VIG(J)25瓶位转瓶机购自兰州飞控仪器总厂生化设备制造厂，Countstar IC1000全自动细胞计数仪购自上海睿钰生物科技有限公司，XDS-1B倒置显微镜购自重庆重光实业有限公司。

将消化后的PHK细胞加入含不同浓度新生牛血清和0.1 mg /ml谷氨酰胺的109液体培养基，配制成为细胞悬液，添加NaHCO₃调节pH至约7.4。共配制6组细胞悬液，PHK细胞接种密度分别为4.5×10⁵、5.2×10⁵、6.1×10⁵、6.8×10⁵、7.3×10⁵、8.2×10⁵ ml^-1，每组3瓶，新生牛血清浓度分别为3%、6%、9%。将上述细胞悬液分别分装约8 000 ml到Corning CF40中, 放入36~38 ℃孵室连续培养3 d，使用破窗锤将细胞工厂拆分成多个单层，用倒置显微镜观察细胞生长情况，并以全自动细胞计数仪进行细胞计数。如果存在几个结果近似的较优新生牛血清浓度与PHK细胞接种密度的组合，则用这些组合重复试验，并以全自动细胞计数仪进行细胞计数，每个组合试验6次，选出*组合。

分别使用不同厂家、同一厂家不同批号或不同厂家混合的新生牛血清制备8组细胞悬液，每组2瓶，1瓶约8 000 ml，含6%新生牛血清，PHK细胞接种密度为6.1×10⁵ ml^-1，转入到1个Corning CF40；另1瓶约14 000 ml，含8%新生牛血清， PHK细胞接种密度为4.7×10⁵ ml^-1，平均分装到7个15 L转瓶。将CF40和15 L转瓶放入36~38 ℃孵室连续培养3 d，以全自动细胞计数仪进行细胞计数，对比两种工艺对新生牛血清的选择性。

制备含6%新生牛血清，接种密度为6.1×10⁵ ml^-1的PHK细胞悬液，分别分装到Corning、Nunc、FeiFanT、DHS的CF40中，体积均约8 000 ml，36~38 ℃孵室连续培养3 d，以全自动细胞计数仪进行细胞计数，比较各厂家的CF40对培养PHK细胞的适用性，每种CF40均测定9次。

使用Excel 2016软件对不同PHK细胞接种密度、不同新生牛血清浓度在CF40上培养的PHK细胞数量绘制折线图分析；使用SPSS Statistics 25.0软件对两个较优组合培养出的PHK细胞数量进行t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。分别计算CF40和15 L转瓶使用不同新生牛血清培养的PHK细胞数量的方差与极差，比较两种工艺对新生牛血清的选择性；使用SPSS Statistics 25.0软件对不同厂家CF40培养的PHK细胞数量进行单因素方差分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

由表1和图1可知，CF40中最佳PHK细胞接种密度为6.1×10⁵ ml^-1，6%、9%新生牛血清明显优于3%新生牛血清。对PHK细胞接种密度为6.1×10⁵ ml^-1时，6%、9%新生牛血清培养出的PHK细胞数量进行 t 检验，t = -0.37，P =0.722。在最佳PHK细胞接种密度下，6%、9%新生牛血清培养出的PHK细胞数量差异无统计学意义。从生产成本上考虑，确定*组合为6.1×10⁵ ml^-1细胞接种密度与6%新生牛血清浓度。

CF40使用不同新生牛血清培养的PHK细胞数量，标准差s₁=0.06×10⁹，极差R₁=0.15×10⁹，均值x̅₁=2.04×10⁹；15 L转瓶使用不同新生牛血清培养的PHK细胞数量，标准差s₂=0.29×10⁹，极差R₂=0.77×10⁹，均值x̅₂=1.44×10⁹。s₁＜s₂，R₁＜R₂，说明CF40培养的PHK细胞数量波动更小；x̅₁＞x̅₂，说明CF40培养的PHK细胞数量更多。综上，CF40工艺对新生牛血清的选择性较低，使用各厂家、批号的新生牛血清均能培养出数量比15 L转瓶工艺多的PHK细胞，具体数据见表2。

对4个厂家CF40培养的PHK细胞数量进行单因素方差分析，F=0.23，P=0.873。表明4个厂家CF40培养出的PHK细胞数量的差异无统计学意义，即PHK细胞对CF40的选择性不高，具体数据见表3。

乙脑病毒属于胞外病毒，病毒在细胞内完成复制组装成熟之后会通过细胞膜进入到病毒维持液中，只需轻轻晃动就可以收集单一病毒收获液，这也是使用细胞工厂制备乙脑减毒活疫苗的天然优势。与15 L转瓶工艺相比细胞工厂有较大的优势，比如操作简单、节省空间、可控性好、静止培养更利于细胞贴壁以及提高PHK细胞生产的一致性等，已经广泛应用于疫苗的生产和研发^[7]。

新生牛血清在PHK细胞培养中起到十分重要的作用，它能终止胰蛋白酶消化，提供细胞生长所需的贴壁因子、促生长因子、免疫球蛋白、胰岛素等营养物质^[8]。目前市场上血清种类繁多，不同厂家及同一厂家不同批次血清质量存在差异，选择合适的血清对细胞培养尤为重要^[9]。本试验采用了不同厂家或同一厂家不同批号或不同厂家混合的新生牛血清培养PHK细胞，试验结果表明，CF40工艺对新生牛血清的选择性低，这可能是和细胞工厂本身的制造工艺和培养方式相关，细胞工厂培养表面经过特殊处理，大大提高了细胞的吸附性，加之采用静止培养方式，对新生牛血清中的贴壁因子要求不高^[10]。综合CF40工艺新生牛血清浓度和对血清的选择性，每亚批CF40使用约500 ml新生牛血清能稳定地培养出约2.0×10⁹ PHK细胞，而15 L转瓶工艺每亚批使用约1 100 ml新生牛血清，培养出的PHK细胞数目波动较大且远少于CF40工艺。

综上，CF40工艺可以稳定地培养出比15 L转瓶工艺更多的PHK细胞，满足乙脑减毒活疫苗生产需求，相比于目前不可控因素较多的转瓶，不论是生产过程控制还是产品质量方面都会有提高。